Competitive Enzym Immunoassay Kit für
Quantitative Analyse von Colistin (CLS)
1. Hintergrund
Colistin ist ein Polypeptid-Antibiotikum, das häufig bei der Heilung von Infektionen mit empfindlichen Organismen und Förderung des Wachstums von Welpen und Geflügel angewendet wird. Es wird als Nahrungsergänzungsmittel und Hemmer von gramnegativen Bakterien wie Bacillus pyocyaneus und Escherichia coli eingesetzt. Colistin wird von der Niere ausgeschieden und kann eine Denaturalisierung des Nierenepithkliums verursachen.
Der gemeinsame Ansatz zum Nachweis von Colistin ist mikrobiologische Hemmungstest. Aufgrund des großen Molgewichts , der starken Polarität und der thermischen Instabilität ist es nicht angebracht, Colistin mit GC zu erkennen, wodurch die Empfindlichkeit und Nachweisgrenze eingeschränkt wird. Enzym-Immunoassay ist präziser und empfindlicher, und einfacher zu bedienen, und kann erheblich minimiert Arbeitsintensität.
2. Prüfprinzip
Dieses Kit basiert auf der ELISA-Technologie von indirekten Mitbewerbern. Die Mikrotiterbrunnen sind mit Kopplungsantigen beschichtet. Colistin-Rückstände in der Probe konkurrieren mit dem auf der Mikrotiterplatte beschichteten Antigen um den Antikörper. Nach der Zugabe von Enzym-Konjugat wird TMB-Substrat verwendet, um die Farbe zu zeigen. Die Absorption der Probe hängt negativ mit dem Colistin zusammen , das darin liegt. Nach dem Vergleich mit der Standardkurve, multipliziert mit dem Verdünnungsfaktor, kann die Colistinrückstandsmenge in der Probe berechnet werden.
3. Bewerbungen
Dieses Kit kann für die quantitative und qualitative Analyse von Colistin in Hühnern und Milch verwendet werden.
4. Kreuzreaktionen
Colistin............................. …100 %
Bacitracin Zink............. …..... …< 1 %
5. Erforderliche Materialien
5,1 Ausrüstung
----Mikrotiterplatten-Spektralphotometer (450nm/630nm)
----Homogenisator
----Vortex-Mixer
----Analytische Balance (Induktivität: 0,01g)
----graduierte Pipette: 10ml
-----Pipettenbirne aus Gummi
----Messkolben: 500ml
----Zentrifugenröhrchen aus Polystyrol: 2ml, 50ml
----Glaszentrifugenröhrchen: 10ml
----Mikropipetten: 20ml-200ml. 100ml-1000ml
250ml-Multipipette
Reagenzien
----Methanol (AR)
---- konzentrierte Schwefelsäure (H2SO4, AR)
----Natriumhydroxid (NaOH, AR)
---- konzentrierte Salzsäure (HCl, AR)
----Natriumchlorid (NaCl, AR)
----entionisiertes Wasser
6. Kit-Komponenten
Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen, mit Antigen beschichtet
Standardlösungen (6 Flaschen, 1ml Flaschen/Flasche)
0ppb, 2,5ppb, 7,5ppb, 22,5ppb, 67,5ppb, 202,5ppb
Spiking Standardlösung : (1ml/Flasche) 10ppm
Enzym-Konjugat 7ml ................….….…rote Kappe
Lösung A 7ml ............…......…weiße Kappe
Lösung B 7ml .........…........….Red Cap
Stopplösung 7ml ...................gelbe Kappe
20×konzentrierte Reinigungslösung 40ml
......................…...transparenter Verschluss
Extraktionslösung 60ml......…......…blaue Kappe
7. Vorbereitung Der Reagenzien
Lösung 1: Gewebeextraktionslösung
8,3ml konzentrierte Salzsäure mit entionisiertem Wasser auf 500ml verdünnen, dann 50g Natriumchlorid hinzugeben und vollständig vermischen.
Lösung 2: 1m NaOH
20g Natriumhydroxid mit entionisiertem Wasser auflösen und auf 500ml verdünnen.
Lösung 3: 2m H2SO4
10ml von 98,3 % H2SO4 mit entionisiertem Wasser auf 90ml verdünnen.
Lösung 4: Extraktionslösung
Die 2×konzentrierte Extraktionslösung mit entionisiertem Wasser im Volumenverhältnis 1:1 verdünnen, das zur Probenextraktion verwendet wird; diese Lösung kann bei 4ºC für 1 Monate gelagert werden.
Lösung 5: Lösung waschen
Verdünnen Sie 20×konzentrierte Reinigungslösung mit entionisiertem Wasser im Volumenverhältnis von 1:19, das zum Waschen der Platten verwendet wird. Diese verdünnte Lösung kann 1 Monate bei 4ºC gelagert werden.
8. Probenvorbereitungen
8,1 Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen vor dem Betrieb:
(A) Bitte verwenden Sie einmalige Tipps während des Experiments, und wechseln Sie die Spitzen, wenn Sie ein anderes Reagenz aufnehmen.
B) sicherstellen, dass alle experimentellen Instrumente sauber sind.
8,2 Hühnerproben
----Probe mit Homogenisator homogenisieren.
---- Nehmen Sie 2,0g±0,05g homogenisierte Probe in ein 50ml Styropor Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 1,8ml Gewebeextraktionslösung (Lösung 1) und 1,2ml Methanol, Vortex für 2min, und dann Zentrifuge für die Trennung: 3000g / Umgebungstemperatur / 5min.
----Nehmen Sie 200µl Supernate, fügen Sie 30μl 1M NaOH (Lösung 2), dann fügen Sie 600µl Extraktionslösung (Lösung 4), Vortex für 20s vollständig zu mischen.
----Nehmen Sie 50µl der vorbereiteten Lösung für die Analyse.
Verdünnungsfaktor............. 10
8,3 Milch
----Nehmen Sie 1ml Milch in ein 2ml Styropor Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 20μl von 2M H2SO4 (Lösung 3) und 300μl Methanol, Vortex für 30s vollständig zu mischen.
----Zentrifuge für die Trennung: 3000g / Umgebungstemperatur / 5min.
----Nehmen Sie 100μl Supernate (vermeiden Sie die schwimmende Substanz), fügen Sie 900μl Extraktionslösung (Lösung 4), Wirbel für 20s.
----Nehmen Sie 50µl der vorbereiteten Lösung für die Analyse.
Verdünnungsfaktor............. 13
9. Assay-Prozess
9,1 Hinweis vor dem Test
9.1.1 Alle Reagenzien und Kavitäten müssen Raumtemperatur (20-25ºC) haben.
9.1.2 Alle restlichen Reagenzien sofort nach Gebrauch auf 2-8ºC zurückgeben.
9.1.3 das korrekte Waschen der Kavitäten ist ein wichtiger Schritt im Assay-Prozess; es ist der entscheidende Faktor für die Reproduzierbarkeit der ELISA-Analyse.
9.1.4 das Licht vermeiden und die Kavitäten während der Inkubation abdecken.
9,2 Testschritte
9.2.1 Alle Reagenzien bei Raumtemperatur (20-25ºC) für mehr als 30min herausnehmen, vor Gebrauch vorsichtig schütteln.
9.2.2 die benötigten Mikrotiterplatten herausholen und den Rest sofort bei 2-8ºC in den Zip-Lock-Beutel zurücklegen.
9.2.3 die verdünnte Reinigungslösung sollte vor dem Gebrauch auf Raumtemperatur belohnen.
9.2.4 Nummer: Nummeriert jede Mikrotiterposition und alle Standards und Proben sollten doppelt durchgeführt werden. Notieren Sie die Positionen für Standards und Proben.
9.2.5 Standard/Probe und Enzym-Konjugat hinzufügen: 50µl Standardlösung (Kit-Komponente) oder vorbereitete Probe zu entsprechenden Vertiefungen hinzufügen. Fügen Sie 50µl Enzym -Konjugat (Kit-Komponente). Mischen Sie die Platte vorsichtig durch manuelles Schütteln und inkubieren Sie sie 30min bei 25ºC mit Deckel.
9.2.6 Waschen: Entfernen Sie den Deckel vorsichtig und reinigen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und spülen Sie die Vertiefungen mit 250µl verdünnter Waschlösung (Lösung 5) im Abstand von 10s für 4-5 Mal. Nehmen Sie das Restwasser mit saugfähigem Papier auf (die restliche Luftblase kann mit nicht verwendeter Spitze beseitigt werden).
9.2.7 Färbung: Fügen Sie 50µl Lösung A (Kit-Komponente) und 50µl Lösung B (Kit-Komponente) zu jeder Well. Mischen Sie die Platte vorsichtig durch manuelles Schaukeln und inkubieren Sie sie 15min bei 25ºC mit Deckel (siehe 12,8).
9.2.8 Messen: 50µl der Stopplösung (Kit-Komponente) zu jeder Vermessung hinzufügen. Mischen Sie die Platte vorsichtig durch manuelles Schütteln und messen Sie die Absorption bei 450nm (Es wird empfohlen, mit der Dual-Wellenlänge von 450/630nm zu messen und das Ergebnis innerhalb von 5min nach Zugabe der Stopplösung zu lesen).
10. Ergebnisse
10,1 Prozent Absorption
Die Mittelwerte der für die Standards und Proben erhaltenen Extinktionswerte werden durch den Extinktionswert der ersten Norm (Nullnorm) geteilt und mit 100% multipliziert. Der Nullstandard wird also auf 100% gesetzt und die Extinktionswerte werden in Prozentsätzen angegeben.
B
Absorption (%) = -- ×100%
B0
B --Absorptionsstandard (oder Probe)
B0 --Absorption Null Standard
10,2 Standardkurve
----um eine Standardkurve zu zeichnen: Nehmen Sie den Absorptionswert der Standards als y-Achse, halb logarithmisch der Konzentration der Colistin-Standardlösung (ppb) als x-Achse.
---- die Colistinkonzentration jeder Probe (ppb), die aus der Kalibrierkurve abgelesen werden kann, wird mit dem entsprechenden Verdünnungsfaktor jeder Probe multipliziert und die tatsächliche Konzentration der Probe wird ermittelt.
Bitte beachten Sie: Für die Datenanalyse wurde eine spezielle Software entwickelt, die auf Anfrage zur Verfügung gestellt werden kann.
11. Empfindlichkeit, Genauigkeit und Präzision
Empfindlichkeit: 2,5ppb
Nachweisgrenze:
Huhn...…........................ …..30ppb
Milch..... …..................... ….30ppb
Genauigkeit:
Huhn...…..................... …85±20 %
Milch..... …........................ 85±15 %
Präzision:
Der C.V. des ELISA-Kits beträgt weniger als 10 %.
12. Hinweis
12,1 die Mittelwerte der für die Standards und Proben erhaltenen Extinktionswerte werden reduziert, wenn die Reagenzien und Proben nicht auf Raumtemperatur (20-25ºC) reguliert wurden.
12,2 Vertiefungen nicht zwischen den einzelnen Schritten trocknen lassen, um eine nicht erfolgreiche Reproduzierbarkeit zu vermeiden, und den nächsten Schritt unmittelbar nach dem Antippen des Kavettenhalters ausführen.
12,3 jedes Reagenz vor Gebrauch vorsichtig schütteln.
12,4 Halten Sie Ihre Haut von der Stopplösung für es ist 0,5M H2SO4 Lösung entfernt.
12,5 Verwenden Sie die Kits nicht veraltet. Tauschen Sie die Reagenzien nicht in verschiedenen Chargen aus, da sonst die Empfindlichkeit sinkt.
12,6 die ELISA-Kits bei 2-8ºC aufbewahren, nicht einfrieren. Versiegelung der Rest-Mikrotiterplatten. Vermeiden Sie direkte Sonneneinstrahlung während aller Inkubationen. Es wird empfohlen, die Mikrotiterplatten abzudecken.
12,7 Substratlösung sollte aufgegeben werden, wenn sie Farben verfärbt. Die Reagenzien können sich als schlecht erweisen, wenn der Absorptionswert (450/630nm) des Nullstandards unter 0,5 (A450nm<0,5) liegt.
12,8 die Farbreaktion benötigt 10-15min nach Zugabe von Lösung A und Lösung B. und Sie können die Inkubationszeit von 20min bis mehr verlängern, wenn die Farbe zu hell ist, um bestimmt werden zu können. Überschreiten Sie niemals 25min, im Gegenteil, verkürzen Sie die Inkubationszeit richtig.
12,9 die optimale Reaktionstemperatur beträgt 25ºC. Eine höhere oder niedrigere Temperatur führt zu Änderungen der Empfindlichkeit und der Absorptionswerte.
13. Lagerung
Lagerungszustand: 2-8ºC.
Lagerdauer: 12 Monate.